【4】リアルタイムRT-PCRとは(1)

基礎

こんにちは、よっぴです☺︎

こんにちは、よっぴです☺︎

新型コロナウイルスのPCRの多くはただのPCRではなく「リアルタイムRT-PCR」だというお話をしました。

リアルタイムRT-PCRって説明できますか?


それくらいできるワン

ほんまかいな・・・


リアルタイムRT-PCRのことが説明できなかったあなたも、今回の記事でリアルタイムRT-PCRの基本的な説明ができるようになります。

新型コロナウイルスであるSARS-CoV-2ウイルスは+鎖RNAウイルスゲノムをもつため、まずRT(Reverse Transcription=逆転写)により一本鎖cDNAを合成し、そのあとPCRにより標的の遺伝子領域を増幅します。


1.RT-PCRステップ

RT-PCRは1ステップと2ステップの2つの方法があります。

1ステップ法は標的特異的プライマーでcDNA合成後標的特異的プライマーでPCR増幅することで簡便かつ高感度に標的領域を増幅でき、多数の処理や感度を求められるウイルスの検査などに使われます。

これに対して2ステップ法はオリゴdTプライマーかランダムプライマーでcDNAを合成し、そのcDNA溶液を次のステップでPCR反応にかけ標的領域を増幅します。

1ステップ法よりもステップは増えますが、PCRへのインプット量を揃えられるため、より高い精度(再現性)を求める遺伝子発現定量解析のような定量的RT-PCRを行いたい場合にこの方法を使います。


2.TaqMan

リアルタイムPCRの検出法は主にTaqMan法とSYBR GREEN法があります。

TaqMan法はTaqManプローブを用いTaq DNAポリメラーゼの5’-3’ヌクレアーゼ活性を使って蛍光を検出する方法で、特異性が高いですがTaqManプローブのコストが高めです。


3.SYBR GREEN

これに対してSYBR GREEN法は二本鎖DNAにインターカレートして蛍光発光するので特異性は低いですがコストは低めです。


4.内部コントロール

定性的なRT-PCRでは特に、RNA抽出やPCRの成功を確認するために、同一の反応内で、定常的に発現している遺伝子か抽出時にスパイクインした核酸を使って内部コントロール反応をかけ、マルチカラーで蛍光波長を検出することが必要です。

この内部コントロール確認手順がなければ、RNA抽出やPCR反応の失敗が起きた場合でも、手順を失敗したのか標的がないのか、あるいは検出感度未満なのかも分からず「偽陰性」となる可能性があり注意が必要です。


References:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16171460/
Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis
Stephen A Bustin et al. Clin Sci (Lond). 2005 Oct;109(4):365-79.

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